1.試驗(yàn)準(zhǔn)備：紫外線照臺(tái)30min，準(zhǔn)備好裝有高壓滅菌好的吸管、試管的飯盒、廢液缸；培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘。在操作臺(tái)上擺放好物品，左邊為飯盒、培養(yǎng)液等，中間為酒精燈、試管架等，右邊放滴管架、鑷子，右上角放廢液缸。

　　2.灼燒培養(yǎng)瓶口及瓶蓋，用滴管取培養(yǎng)基5ml加入試管中（一滴約為50ul）。

　　3.戴手套，從-196℃液氮罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，同時(shí)不斷輕輕搖動(dòng)凍存管，保證凍存管內(nèi)細(xì)胞1min內(nèi)融化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)（慢凍快融）。

　　4.用吸細(xì)胞液的滴管從凍存管中*吸出細(xì)胞懸液，加入到已裝有培養(yǎng)基的試管中，塞子塞試管，800rpm離心2min，棄上清，試管底部的白色物質(zhì)為細(xì)胞，輕彈混勻。往試管中加培養(yǎng)基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS濃度為20％）。用吸細(xì)胞液的滴管輕輕吹打，使細(xì)胞混勻，以免在培養(yǎng)瓶里成團(tuán)，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

　　5.將試管中的細(xì)胞懸液用吸細(xì)胞液的滴管全部吸出，加到培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記日期、細(xì)胞名稱，再把培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱。

　　6.收拾所用物品、用75%酒精噴灑操作臺(tái)，擦臺(tái)，保持臺(tái)面整潔。

　　注意事項(xiàng)：

　　1.入細(xì)胞室前觀察CO2%壓力，5-7.5mPa左右，減壓器表壓力不低于0.1mPa。

　　2.剛復(fù)蘇的細(xì)胞需要的營(yíng)養(yǎng)成分更多些，讓FBS濃度達(dá)到20％。

　　3.離心時(shí)間為1-2min，速度為800轉(zhuǎn)，不要離心太久，避免對(duì)細(xì)胞傷害較大。

　　4.小心使用滴管，培養(yǎng)基和胎牛血清可以用一個(gè)滴管，但分開用更好。

　　5.不是所有的細(xì)胞復(fù)蘇后都能活。死亡原因有的是因?yàn)閮龃鏁r(shí)間太長(zhǎng)（如2年以上），技術(shù)不過關(guān)（如吹打太激烈）、細(xì)胞傳代數(shù)太多等。

　　6.DMSO（二甲基亞砜）在常溫下對(duì)細(xì)胞毒性較大，而在4℃時(shí)，其毒性大大減弱，故凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后應(yīng)及時(shí)洗滌冷凍保護(hù)劑DMSO（離心后棄去上清），防止DMSO在常溫下對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大毒性！

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